/Fuente: Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos Aires /

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Un trabajo de un grupo del Servicio de Hematología y Oncología del Hospital de Pediatría “Prof. Dr. Juan P. Garrahan”, recientemente publicado en ABCL, describe una técnica espectrofotométrica que permite determinar la hemoglobina libre en plasma (HLP) utilizando pequeños volúmenes (1).

Tapa del Vol. 60 Núm. 1 (2026) Edición Enero – Marzo de la revista Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana, donde se publica el trabajo “Cuantificación de hemoglobina libre en plasma por espectrofotometría de microvolumen”.

Como sabemos y lo explican los autores de dicho trabajo, la hemoglobina (Hb) es una metaloproteína tetramérica presente en los eritrocitos que cumple un rol esencial en el transporte de oxígeno desde los pulmones hasta los tejidos. Cuando esta molécula se mantiene dentro de los glóbulos rojos puede cumplir su función sin provocar daño. Sin embargo, en situaciones patológicas, los eritrocitos pueden romperse y liberar su contenido al plasma. Esto produce un aumento de HLP, que resulta altamente tóxico ya que el hemo libre puede causar daño oxidativo (2) (3).

La HLP es uno de los biomarcadores más específicos de hemólisis intravascular (4). Una vez liberada al plasma, la Hb libre se une rápidamente a la haptoglobina, una proteína plasmática encargada de neutralizar su toxicidad. Este complejo es reconocido por receptores específicos del sistema mononuclear fagocítico (SMF), principalmente en el hígado, y eliminado de la circulación. Sin embargo, esta vía se satura fácilmente en situaciones de hemólisis aguda o crónica, lo que permite la acumulación de grandes cantidades de HLP (2) (3)

Durante la hemólisis, es importante distinguir dos mecanismos principales: la hemólisis extravascular, donde los eritrocitos son destruidos por el SMF del bazo o del hígado y, la hemólisis intravascular, que ocurre directamente en el torrente sanguíneo. La primera se asocia con un aumento de bilirrubina indirecta, mientras que la segunda se caracteriza por un descenso de haptoglobina y hemopexina, aumento de metahemalbúmina y, especialmente, un incremento de HLP, considerado un marcador clave para detectar daño hemolítico directo en circulación (2) (3).

Cuando la capacidad de neutralización se ve superada, la HLP puede generar múltiples efectos deletéreos. Uno de los más significativos es su capacidad de secuestrar óxido nítrico (NO), un vasodilatador crucial en la regulación del tono vascular. La alta afinidad de la hemoglobina libre por el NO reduce su biodisponibilidad y así produce vasoconstricción, hipertensión, disfunción endotelial y menor perfusión tisular, efectos particularmente graves en el lecho pulmonar, renal y cerebral. A su vez, el hemo libre y el hierro no ligado favorecen reacciones redox que generan radicales libres altamente reactivos que dañan membranas, proteínas y ácidos nucleicos. Además, estas moléculas pueden iniciar una cascada inflamatoria sistémica con activación del complemento, liberación de citoquinas proinflamatorias y riesgo de evolución hacia un síndrome de disfunción multiorgánica (2) (3).

Una valiosa herramienta clínica

En condiciones normales, la concentración de HLP en plasma es indetectable o menor de 10 mg/dL. Cuando esta barrera se supera, como en casos de hemólisis activa, los efectos tóxicos se potencian. Concentraciones entre 50 y 100 mg/dL se asocian a hemólisis moderada, mientras que niveles superiores a 100 mg/dL indican hemólisis severa y mayor riesgo de daño multiorgánico (5).

Por estas razones, la cuantificación de HLP se ha consolidado como una herramienta clínica de gran valor. No sólo permite confirmar la presencia de hemólisis intravascular, sino también evaluar su evolución y anticipar complicaciones graves. En cuadros como la sepsis, los niveles de HLP durante las primeras 24 horas tienen un valor pronóstico superior al de biomarcadores tradicionales como la procalcitonina, y se correlaciona con una mayor mortalidad a 30 días.

Uno de los principales desafíos en la cuantificación de HLP son las interferencias de sustancias como bilirrubina y lípidos. No existe un método estándar para medir HLP en presencia de estas interferencias, lo que ha llevado al desarrollo de técnicas con limitaciones en sensibilidad, especificidad y practicidad.

Dentro de los métodos espectrofotométricos, hay varios que difieren en las longitudes de onda empleadas y en la necesidad o no de realizar una dilución alcalina, buscando en todos los casos corregir interferencias y mejorar la precisión (1).

Espectrofotometría de microvolumen

El estudio publicado en ABCL presenta una nueva metodología para cuantificar HLP mediante espectrofotometría de microvolumen, utilizando una sola gota de plasma para medir la absorción de luz en el rango UV-visible. Esta técnica permite un análisis visual del barrido espectral de la muestra y resulta en una ecuación polinómica de regresión múltiple que considera simultáneamente la influencia de la bilirrubina y los lípidos en la concentración final de la HLP (1).

La medición de HLP en el pico de 414-415 nm proporciona señales fuertes de absorbancia, pero está sujeta a interferencias de bilirrubina y lípidos. La medición en 577 nm, aunque menos intensa, está más alejada de las interferencias y evita la dilución de las muestras. Sin embargo, la descomposición de la oxihemoglobina con el tiempo y la precisión requerida en los espectrofotómetros presentan desafíos. Los métodos actuales miden concentraciones de HLP hasta 200-250 mg/dL sin dilución, pero por encima de estos valores, la absorbancia excede el rango lineal de los espectrofotómetros (1).

Es crucial que los métodos de cuantificación de HLP sean consistentes entre instituciones para asegurar una evaluación precisa, especialmente en dispositivos médicos. Un método ideal debe medir niveles de HLP entre 0 y 1000 mg/dL, no verse afectado por bilirrubina o lípidos, ser rápido, fácil de usar y no requerir productos químicos peligrosos (1).

La espectrofotometría de microvolumen es una técnica prometedora para cuantificar HLP. Usa un pequeño volumen de plasma, lo que la hace ideal para pacientes pediátricos. Además, permite la evaluación visual de los espectros de absorbancia mientras cuantifica HLP, lo que ayuda a identificar interferencias. Esta técnica es muy sensible, específica y precisa, con un error comparable a otros métodos establecidos (1).

La espectrofotometría de microvolumen representa un avance significativo en la cuantificación de HLP, al ofrecer alta precisión y facilidad de implementación, tanto en entornos clínicos como de investigación. Si bien presenta limitaciones en cuanto al costo y la cantidad de muestras procesables, la demanda para la medición de HLP no es suficientemente alta como para que la técnica se utilice masivamente. Su capacidad para detectar interferencias y su potencial para mejorar la cuantificación y monitorización de patologías relacionadas con alteraciones en los niveles de HLP le otorgan un importante valor diagnóstico y terapéutico (1).

Referencias bibliográficas

• Aguirre FM, Fernández DA, González MM, Nieto LS, Eandi Eberle SJ. Cuantificación de hemoglobina libre en plasma por espectrofotometría de microvolumen. Acta Bioquím Clín Latinoam 2026; 60 (1): 19-31.
• Rother RP, Bell L, Hillmen P, Gladwin MT. The clinical sequelae of intravascular hemolysis and extracellular plasma hemoglobin: a novel mechanism of human disease. JAMA 2005; 293(13): 1653–62.
• Dufour N, Radjou A, Thuong M. Hemolysis and plasma free hemoglobin during extracorporeal membrane oxygenation support: from clinical implications to laboratory details. ASAIO J 2020; 66 (3): 239–46. doi.10.1097/MAT.0000000000000974.
• Guarda CCD, Santiago RP, Fiuza LM, Aleluia MM, Ferreira JRD, Figueiredo CVB, et al. Heme-mediated cell activation: the inflammatory puzzle of sickle cell anemia. Expert Rev Hematol 2017; 10 (6): 533–41. doi 10.1080/17474086.2017.1327809.
• Rosa CM, Mereles SM, Rigacci MF, Colimodio DC. Hemoglobina libre en plasma por espectrofotometría directa. Revista Hematología 2020; 24 (2): 91–6.